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活血祛瘀法诱导人真性红细胞增多症细胞凋亡及对基因表达的影响

摘要：目的:探讨活血祛瘀法治疗真性红细胞增多症的作用机理。方法:选取真性红细胞增多症初治或未缓解的住院及门诊病人10例,以活血祛瘀药治疗12周,并设立正常对照组，并在治疗前，治疗后1周、4周、8周、12周采用TUNEL法检测治疗前后真性红细胞增多症病人骨髓单个核细胞的凋亡率，以免疫组化法检测治疗前后Bcl-2、P53基因，用原位杂交法检测上述基因水平mRNA表达。结果:治疗前至治疗后24小时患者骨髓单个核细胞凋亡率与正常对照组差异无显著性意义（P＞0.05）；而治疗后1周、4周、8周，其凋亡率较前一个观察时点逐步增高（P值均＜0.05)；治疗后12周与治疗后8周比较，患者骨髓单个核细胞凋亡率的差异无显著性意义（P＞0.05）。治疗前患者bcl-2基因及其mRNA、P53基因及其mRNA水平均高于正常对照组(P＜0.05)；治疗后4周bcl-2mRNA、治疗后8周bcl-2基因及其mRNA、治疗后4周和8周P53基因及其mRNA表达均低于治疗前(P＜0.05）。结论：活血祛瘀法治疗真性红细胞增多症的起效时间可能在治疗后第8周达到高峰，此后若继续用药，其疗效趋于平稳。活血祛瘀法抗真性红细胞增多症的疗效机理之一可能是通过调节bcl-2基因及其mRNA、P53基因及其mRNA水平表达，从而诱导真性红细胞增多症骨髓单个核细胞凋亡。




关键词：活血祛瘀  真性红细胞增多症  细胞凋亡  基因调控




真性红细胞增多症（常简称真红）是一种造血干细胞获得性恶性克隆性增生所致的疾病，以血细胞增多导致全血容量增多，血液粘稠度增高症候群为临床特征，属骨髓增生性疾患之一。目前，西医治疗本病主要采用化疗或结合放血疗法，疗效尚可，但毒副作用明显；目前，中医治疗真性红细胞增多症主要采用活血祛瘀法为基础，结合辨证加用养阴、清热、益气等法，取得明显效果，其疗效已得到国内血液学界公认[1-3]；但活血祛瘀法对于本病的疗效机理则鲜见报道。本研究试图从细胞凋亡及其相关基因角度探讨这一机理。现将初步观察结果报告如下。

1临床资料

1.1一般资料  本组病人10例，其中男6例，女4例；年龄35～75岁，平均61.38岁。

1.2诊断标准  参照张之南主编《血液病诊断与疗效标准》中真性红细胞增多症

的国内诊断标准[4]：（内容略）

1.3纳入标准  符合诊断标准；未曾接受过化疗，或已停用化疗1个月以上，能

配合服用中药治疗及复查者。

1.4排除标准  不符合纳入标准者；不能配合治疗、复查者；继发性或相对性红

细胞增多症；孕妇或合并有严重心肝肾功能损害者。

1.5疗效标准  参照张之南主编《血液病诊断与疗效标准》中真性红细胞增多症的国内疗效标准 [4]：

1.5.1完全缓解  临床症状消失，皮肤、粘膜从红紫恢复到正常，原肿大的肝脾显著回缩，血红蛋白恢复正常，白细胞和血小板计数降至正常。若红细胞容量也恢复正常，则称完全缓解。

1.5.2临床缓解  临床及血象恢复如上，但未测红细胞容量或测红细胞容量尚未恢复正常。

1.5.3好转  临床症状明显改善，皮肤、粘膜红紫有所减轻，原肿大的肝脾有所回缩，血红蛋白下降30g/L以上。

1.5.4无效  临床症状、体征以及血象无变化或改善不明显。

2材料与方法

2.1材料与设备  流式细胞仪（型号EPICS ALTRA）：美国Coulter公司产；Bcl-2或P53免疫组化染色超敏试剂盒[含过氧化物酶阻断溶液（Hydrogen Peroxidase Blocking Solution），Ultro V block，即用型生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotinylated Goat anti-Mouse），链亲和素-过氧化物酶溶液（Strptavidin Peroxidase），一抗（Primary Antibody）即鼠抗人Bcl-2或P53]、人Bcl-2 mRNA、P53 mRNA及Fas mRNA原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒、原位杂交专用盖玻片、焦碳酸二乙酯（DEPC）均购自武汉博士德生物工程有限公司；多聚左旋赖氨酸：Sigma公司出品；淋巴细胞分层液购自福建迈新生物工程公司；多聚甲醛、柠檬酸、丙酮、磷酸二氢钠、氯化钠、精蛋白胰岛素/核糖核酸酶A溶液等试剂购自广州化学试剂公司。

2.2分组及给药

2.2.1观察组  给予活血祛瘀中药汤剂（桃仁15g，红花15g，赤芍15g，地龙15g，川牛膝20g，莪术15g等），每日1剂，加水800ml，煎成300ml，分两次温服；并予本院制剂消瘀灵丸(由《金匮》大黄蟅虫丸加减而成，具有活血祛瘀之功)，每次4～6g，每日3次。服药期间不用任何有效西药。

2.2.2正常对照组  为本校健康在校研究生志愿者，不给予任何药物干预。

2.3 TUNEL法检测骨髓单个核细胞凋亡

2.3.1单个核细胞分离  取淋巴细胞分层液4ml置入干燥离心管中，用吸管吸取抗凝骨髓液2ml，在距离分层液上1cm处徐徐沿管壁加入，使淋巴细胞分层液叠于骨髓液上。3000r/min离心，20～25min，离心后绝大多数PMNC悬浮于血浆与淋巴细胞分层液之间，用吸管吸出PMNC，移入另一干燥离心管中，加入5倍以上体积PBS，1000r/min离心，5～10min�3次，在显微镜下计数，制成106/L的单个核细胞悬液。

2.3.2细胞固定  PMNC悬液加入1％多聚甲醛冰浴15min，以3000r/min�5min离心，弃上清，用PBS洗两次，制成0.5ml的PBS细胞悬液，试管中加入5ml冷70％乙醇，在加入0.5ml的细胞悬液，冰浴放24h，再进行细胞凋亡的检测。

2.3.3细胞凋亡检测  取1�106/LPMNC悬液，置1500r/min�8min离心，弃乙醇。加1mlWash缓冲液，洗两次。加DNA标记液50�l，混匀，同型对照组省去该步骤。37℃温浴60min，每15min摇匀1次。各管加1mlRinse缓冲液，1500 r/min�5min离心，弃上清，洗两次。加入0.5ml PI/Rnase A Solution（精蛋白胰岛素/核糖核酸酶A溶液）。室温避光反应30min，3h内上机检测。

2.3.4 Bcl-2或P53免疫组化检测

2.3.4.1细胞涂片的制作  将分离到的单个核细胞用PBS稀释，调整细胞浓度为106/ml，均匀涂片，室温晾干，4℃丙酮固定10min，置4℃冰箱保存。

2.3.4.2免疫组织化学染色检测Bcl-2，P53  涂片用PBS(PH=7.4)冲洗5min�3次；加50μl过氧化酶阻断剂，室温下孵育10min，PBS冲洗5min�3次；加50μl Ultro V block，室温下孵育5～10min，PBS冲洗3次；加50μl一抗，室温下孵育15分钟，PBS冲洗5min�3次；加50ul链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min，PBS冲洗5min�3次；加100μl新鲜配剂DAB溶液，室温下2min，自来水冲洗，苏木素复染，中性树脂封固。阴性对照：以PBS代替一抗。

2.3.5原位杂交法检测Bcl-2 mRNA、P53 mRNA表达  将单个核细胞在经左旋多聚赖氨酸处理过的载玻片（将硅化玻片浸泡于多聚赖氨酸和蒸馏水按1：10配好的液体中5min，室温晾干，密封保存）制成涂片；以4％多聚甲醛/0.01克分子PBS（PH7.2～7.4）室温下固定30～60min。蒸馏水充分洗涤后干燥；以新鲜配制0.5％过氧化氢/甲醇，室温下处理30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤3次；玻片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3％柠檬酸加0.4ml浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化0.5～2min，0.01克分子PBS洗5min�3次，蒸馏水洗1次,以暴露mRNA核酸片段；杂交盒底部加20％甘油20ml以保持湿度，按每张玻片20μl加预杂交液，置恒温箱37～40℃下2h～4h，吸取多余液体，不洗；按每张玻片20μl的比例，加上杂交液，再将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在玻片上，置恒温箱40～42℃杂交过夜；揭掉盖玻片，30～37℃左右水温的2�SSC洗涤5min�2次，0.5�SSC洗涤15min�1次，0.2�SSC洗涤15min�1次；滴加封闭液,37℃�30min，甩去多余液体，不洗；滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃�60min，0.01克分子PBS洗5min�4次；滴加SABC,37℃�20min，0.01mol/L PBS洗5min�3次；滴加生物素化过氧化物酶,37℃�20min，0.01克分子PBS洗5min�4次；DAB显色：用1ml蒸馏水加DAB显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色25min，充分水洗涤；苏木素复染，充分水洗；乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

2.3.6 Bcl-2，P53基因及其mRNA表达结果判断  阳性信号均为棕黄色细小颗粒，主要定位于细胞核；阴性结果为未见上述颗粒。

2.3.7 统计方法  治疗前后自身对照，采用SPSS10.0统计软件包。

3结果

3.1骨髓单个核细胞凋亡情况  参见表1。

结果经组间t检验，治疗组治疗前与正常对照组比较，P＞0.05，提示治疗前真性红细胞增多症患者骨髓单个核细胞凋亡率与正常对照组差异无显著性意义；经自身配对t检验，治疗后24小时患者骨髓单个核细胞凋亡率与治疗前比较，P＞0.05，差异无显著性意义；治疗后1周与治疗前、治疗后4周与治疗后1周、治疗后8周与治疗后4周分别进行比较，差异均有显著性意义（P＜0.05），提示使用活血祛瘀中药后，3个时点患者骨髓单个核细胞凋亡率逐步增高；而治疗后12周与治疗后8周比较，P＞0.05，提示此两个时点患者骨髓单个核细胞凋亡率的差异无显著性意义。

表1  治疗前及治疗后不同时点骨髓单个核细胞凋亡率（％, X�S）组  别治疗前 治疗后 24h1w4w8w12w治疗组5.38�0.026.00�0.0217.75�0.03*24.25�0.03△29.00�0.04△29.38�0.02△正常组3.75�0.023.24�0.093.81�0.063.43�0.013.62�0.033.89�0.07注：与治疗前相比，*P＜0.05；与前一时点比较，△P＜0.05




3.2治疗前后bcl-2，P53基因表达情况  参见表2。

表2  治疗前及治疗后不同时点bcl-2，P53基因表达情况（％, X�S）组  别基因治疗前治疗 后1w4w8w12w治疗组bcl-233.63�2.91△32.31�2.9531.00�2.3516.63�2.49*15.88�1.73*正常组bcl-210.01�1.0510.10�1.0911.12�1.2110.32�2.0111.21�2.18治疗组P5325.31�2.10△24.69�1.4417.88�1.70*13.38�1.22*12.43�1.88*正常组P5300.11�0.021.03�0.9101.01�0.87注：治疗组与正常组比较，△P＜0.05；治疗后与治疗前比较，*P＜0.05

经组间t检验，治疗组治疗前与正常对照组比较，P＜0.05，提示治疗前患者bcl-2、P53基因水平高于正常对照组，差异有显著性意义；经自身配对t检验，治疗后1周与治疗前比较，P＞0.05，提示此时患者bcl-2、P53基因水平较治疗前差异无显著性意义；治疗后4周bcl-2和P53基因水平分别与治疗前比较，P值分别＞0.05和＜0.05，提示此时患者bcl-2和P53基因水平分别较治疗前差异无显著性意义和有显著性意义；治疗后8周bcl-2和P53基因水平与治疗前比较，P值均＜0.05，提示此时点与治疗前比较，患者bcl-2和P53基因水平均降低，差异均有显著性意义；治疗后12周bcl-2和P53基因水平与治疗前相比较，差异均有显著性意义（P＜0.05）。

3.3治疗前后bcl-2，P53基因mRNA水平表达情况  参见表3。

经组间t检验，治疗组治疗前与正常对照组比较，P＜0.05，提示治疗前患者骨髓单个核细胞bcl-2mRNA、P53mRNA水平表达高于正常对照组，差异有显著性意义；经自身配对t检验，治疗后1周骨髓单个核细胞bcl-2mRNA和P53mRNA与治

疗前比较，P值均＞0.05，提示此时较治疗前患者bcl-2mRNA和P53mRNA水平表达差异均无显著性意义；治疗后4周、8周、12周，bcl-2mRNA和P53mRNA分别较治疗前、治疗后4周，P值均＜0.05，差异均有显著性意义，提示此2时点患者bcl-2mRNA和P53mRNA水平表达逐步下降；治疗后12周bcl-2mRNA和P53mRNA水平表达较治疗后8周，P值均＞0.05，差异无显著性意义，提示此时点患者bcl-2mRNA和P53mRNA水平表达无进一步下降。




表3  治疗前及治疗后不同时点bcl-2，P53mRNA水平表达情况（％, X�S）组  别基因治疗前治疗 后1周4周8周12周治疗组bcl-2mRNA30.49�3.4929.44�4.9326.69�3.1316.48�2.1715.63�1.25正常组bcl-2mRNA6.32�2.015.56�5.125.22�3.275.34�2.345.35�3.02治疗组P53 mRNA16.91�1.6815.75�1.8315.00�1.9311.45�1.6811.25�2.48正常组P53 mRNA00000

4讨论

骨髓单个核细胞主要包括幼稚红细胞、白细胞和巨核细胞，即为外周血血细胞的前体细胞。本研究观察真性红细胞增多症患者用活血祛瘀中药治疗前后骨髓单个核细胞的凋亡情况，可反映其治疗效应。研究结果发现，治疗后24小时，骨髓单个核细胞的凋亡率与正常对照组自然凋亡率比较无明显差异（P＞0.05）；治疗后1周、4周、8周，其细胞凋亡率较治疗前逐步升高，各时点的凋亡率差异均有显著性意义（P值均＜0.05）；但至治疗后12周，其凋亡率较治疗后8周再无明显差异（P＜0.05）。提示活血祛瘀法治疗真性红细胞增多症的显效期可能在治疗后第8周达到高峰，此后若继续用药，其凋亡率趋于平稳；亦即表明活血祛瘀中药起效较慢，与临床上以中医药活血祛瘀治疗本病往往需要用药4～8周乃至更长时间，才能取得较好疗效的观察结果相符。

一般认为，bcl-2、P53、c-myc等是调控肿瘤细胞凋亡的关键基因，其中bcl-2抑制细胞凋亡；P53基因分为野生型和突变型两种，前者主要有促凋亡作用，后者主要抑制细胞凋亡；c-myc基因则主要起促凋亡作用[5]。由于野生型P53基因的半衰期很短，仅20分钟，积聚水平甚低，一般难以检测；故用免疫组化法检测到的P53蛋白均为突变型P53基因。正常对照组因无P53基因变异，故本研究中P53基因及其mRNA的阳性率均为0。本研究显示，真性红细胞增多症患者治疗前bcl-2及其mRNA、P53及其mRNA水平均明显高于正常对照组（P＜0.05），提示真性红细胞增多症患者血细胞增多的原因可能与bcl-2及其mRNA、P53及其mRNA的高表达有关，即在真性红细胞增多症发病过程中，由于P53基因变异，突变型P53抑制野生型P53对细胞凋亡的调控作用，以致造血干祖细胞不能正常凋亡而堆积体内为患；经活血祛瘀中药治疗后，患者bcl-2及其mRNA、P53及其mRNA的高表达均明显下调，结果与我们对急性白血病病人以及小鼠白血病模型细胞凋亡相关基因的研究观察结果相似[6-7]；且随着用药时间的延长，其下调作用日益明显，到用药第8周达高峰，以后趋于平稳。由于人体细胞体外生存时间所限等原因，我们的观察时间暂未能进一步延长；有待于将来改进技术条件，再行观察。

从本研究结果我们可推论，bcl-2、P53等癌基因的高表达可能抑制造血干祖细胞的分化与凋亡，从而导致患者出现血细胞的堆积和组织浸润，表现出真性红细胞增多症的各种临床症状、体征，以及血象和骨髓象的异常。活血祛瘀法对真红有肯定疗效，且其作用机理之一可能是通过调节bcl-2基因及其mRNA、P53基因及其mRNA水平表达，从而诱导真性红细胞增多症细胞凋亡。

参考文献

[1]张大龙. 活血祛瘀治疗真性红细胞增多症20例疗效观察。天津中医[J]，1987，（3）：28.

[2]王天恩，李惠荣，许勇刚. 泻肝活血法治疗真性红细胞增多症10例临床观察。吉林中医药[J]，1996，（2）：8.

[3]郑翠娥，郑延国. 血府逐瘀汤合益气养阴方治疗真性红细胞增多症15例。山东中医杂志[J]，1997，16（6）：254.

[4]张之南. 《血液病诊断及疗效标准》（第二版），科学出版社，北京：1998.2.

[5]成军. 《程序化细胞死亡与疾病》，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，北京：1997.2.

[6]杨洪涌，游江，马月等. 清毒饮和养正片对急性白血病人Bcl-2、P53、Fas基因及其mRNA表达的影响。湖北中医学院学报[J]，2003，3（9）：32～34.

[7]杨洪涌，潘习龙，丘和明等. 清毒饮和养正片诱导L7212小鼠白血病细胞凋亡及其对Bcl-2,P53基因表达的影响。新中医[J]，2002；34（6）：69～71.

 Inducing Apoptosis of Bone Marrow Mononuclear Cells ofPV Patients and Affecting Expression of bcl-2 & P53

and Their mRNA by TCM Treatment of Activating

Blood Circulation to Dissipate Blood Stasis

（Abstract）Keywords: PV  TCM Treatment  Mechanism  Apoptosis  Gene ExpressionYang Hongyong, Sun Jinfang, Chen Zhixiong,, Zhao Zhenping  Gu Xuekui, Liu anping

Polycythemia Vera（PV）is a kind of acquired clonal disorder of the hemopoietic stem cell with proliferation of erythrocyte, which is included in the disorder of myeloproliferative www.yihu.com has clinical manifestations of long course, erythrocytosis and hypervolemia and physical signs of purple skin and www.yihu.com these features are diagnosed as symptoms of blood stasis in www.yihu.com PV can be treated with TCM method of activating blood circulation to dissipate blood stasis.

In this study, the method of case-control study before and after treatment combined with normal controls had been www.yihu.com PV patients were treated with TCM method of activating blood circulation to dissipate blood www.yihu.com and after treatment, the bone marrow mononuclear cells were analyzed about the apoptosis rates with the TUNEL method and the expression of bcl-2 and P53 by the methods of immunohistochemistry, and the hybridization in site for their mRNA expression.

The results showed that the apoptosis rates the bone marrow mononuclear cells of PV patients had no significant difference between the before treatment group and the normal control group（P＞0.05）, and no significant difference between the before treatment group and the 24-hour treatment group as well（P＞0.05）. Compared with the before treatment group, the 1 week treatment group and the 4 week treatment group respectively, the 1 week treatment group, 4 week treatment group and the 8 week treatment group had significantly different apoptosis rates which increased one by one（P＜0.05＝, while, the apoptosis rates have no significant difference between 8 week treatment group and the 12 week treatment group（P＞0.05）.

The gene expression of bcl-2 and P53 in the patients of the before treatment group were higher than the normal control group with significant difference（P＜0.05＝, but no different from the 1 week treatment group（P＞0.05）.Between the 1week group and the 4 week group, the bcl-2 expression was not significantly different （P＞0.05）but the P53 expression was significant difference（P＜0.05＝. The 8 week treatment group had a decreased expression level of both bcl-2 and P53 compared with the before treatment group（P＜0.05＝, but had no significant difference with the 12 week treatment group（P＞0.05）,which displayed no decreasing expression of bcl-2 and P53 www.yihu.com the expression of bcl-2 and P53 in mRNA decreased between the before treatment and 4 weeks after treatment with significant difference（P＜0.05＝.

The results revealed that the treatment of activating blood circulation to dissipate blood stasis could reach its peak effect at the 8 week after treatment, and tend to keep stable with the continuation of www.yihu.com is indicated that the effect of the TCM treatment worked www.yihu.com always took the medicine 8 weeks or longer time to reach better www.yihu.com could be deduced that high level of expression of such oncogene as bcl-2 and P53 could inhibit the differentiation and apoptosis of hemopoietic stem progenitors and the TCM method of activating blood circulation to dissipate blood stasis could work on PV with certain www.yihu.com mechanism probably involved the regulation expression of bcl-2 and P53and their mRNA expression, which induced the apoptosis in PV patients.




[1] 国家中医药管理局科研基金资助项目（合同号：00-J-P-69）